美妥珠(HcHAb18)单抗质量标准的建立及理化对照品结构确证

范文红，陶磊，李响，韩春梅，杨靖青，丁有学，裴德宁，郭莹，饶春明，王军志

中国食品药品检定研究院重组药物室 卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050

摘要:目的: 建立美妥珠单抗的质控方法和质量标准。方法: 利用乳酸脱氢酶检 查外周血分离的单核细胞对人肺腺癌A549细胞的杀伤效应测定美妥珠单抗的生 物学活性;非还原CE-SDS和SEC-HPLC 测定纯度;胰酶酶切，HPLC 测定其 肽图; 实时定量PCR 检测CHO 宿主DNA 残留量;采用ELISA 法分别测定抗原 CD147结合力、残留ProA 含量和残留宿主蛋白含量;CE-SDS法测定等电点; 液质联用技术进行分子量、肽图及糖型分析;其余检测项目按中国药典2010 年 版三部规定进行。结果: 用建立的方法对美妥珠单抗的成品进行了检定，各项指 标均符合《人用重组DNA 制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质 量控制技术指导原则》和中国药典2010 年版三部的要求;对理化对照品进行了 一级结构确证，分子量、氨基酸序列糖型分析结果均与理论预测相符。结论: 建 立的质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特点，可用于该 类产品的常规检定。

随着重组技术药物的迅速发展，针对恶性肿瘤的靶向性单克隆抗体药物的研 发越来越引起药物研发人员的关注，美妥珠(HcHAb18)单抗是用于非小细胞 肺癌靶向治疗的一种人源化修饰型嵌合IgG1单克隆抗体，经糖基化修饰，具有明 显的抗体依赖的细胞毒(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)增 强效应。其靶抗原是HAb18G/CD147分子，CD147是一种高度糖基化的广泛表达 于正常细胞的粘附分子，同时也是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)诱导因子，已被证实在乳腺癌、肝癌、食管癌、结肠癌、卵巢癌等多种

恶性肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤细胞的侵袭性[1-4]。美妥珠(HcHAb18)单 抗可与分布在肺癌细胞膜蛋白中的HAb18G/CD147抗原结合，并利用抗体介导的 ADCC作用杀伤肿瘤细胞，在抗肺癌及其转移的药效学实验中显示了良好的抑瘤 和抑制转移效果。

美妥珠单抗是一种新型抗体，国内外均未上市。为了有效地对该产品的质量 进行控制，保证其安全、有效，根据《人用重组DNA制品质量控制技术指导原 则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》和中国药典2010年版三部的要 求，结合该产品的特点，建立了一套完整的质量标准，并利用液质联用技术对其 理化对照品的一级结构进行了结构确证。
 

1 材料和方法
1.1 供试品及主要试剂 供试品为美妥珠(HcHAb18)单抗的成品和理化对照品， 由申报单位提供。CD147抗原、肺腺癌细胞A549、新鲜外周血、淋巴细胞分离 液由申报单位提供;CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒购自Promega公司; RPMI1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG (goat anti-human IgG HRP)为Jackson Immuno公司产品。ProteomeLab SDS-MW Analysis Kit购自Beckman公司。
1.2 仪器设备 美国Molecular Devices公司Spectra Max 多功能酶标仪及 SOFTMAX 分析软件;SHIMADZU SSPQ-21蛋白分析系统;高效液相色谱系统 (Waters Alliance 2695);二极管阵列检测器(Waters2996);质谱仪(Q-TOF Micro); Masslynx4.0操作软件;毛细管电泳仪(Beckman Coulter PA800)
1.3 纯度分析
1.3.1 非还原毛细管电泳法(non-reducing CE-SDS):SDS-MW分析试剂盒 (Beckman Coulter，390953)，利用光电二极管阵列检测器(PDA)的PA800 plus 毛细管电泳系统(Beckman Coulter)，通过测定每种组分的校正峰面积百分比来 评估样品的纯度。进样方式:电压进样(5kV);进行时间:10sec;分离电压: 15kV;分离时间:30min。检测波长:200n。
1.3.2 分子筛高效液相色谱法(SEC-HPLC):色谱柱:TSKG3000SWXL;流 动相:0.01mol/L PBS缓冲液(pH7.2);流速:0.5 mL·min-1;柱温:室温;检测

波长280 nm，上样量不低于20μg。用Waters 高效液相分析仪2695 系统工作站对 实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算出其纯度。
1.3.3 二聚体和多聚体含量测定 方法同分子筛高效液相色谱法。
1.4 质谱分子量测定 取理化对照品溶液100 μL, 加入0.1mol·L−1 DTT 1 μL, 37 °C水浴1 h, 加入糖苷酶5 μL,37 °C水浴3 h。用Waters Alliance 2695 及Q-TOF Micro 进行测定, 方法参照文献[5]。

−1
1.5 液质肽谱分析 用0.5 mL 超纯水复溶理化对照品至浓度约3 mg·mL , 对50

mmol·L−1碳酸氢铵溶液透析过夜。取200 μg 分装冻干, 按说明书步骤对冻干样品 进行胰蛋白酶酶解, 完毕后平分为两份, 一份加入糖苷酶10 μL, 一份加入糖苷 酶缓冲液10 μL, 37 °C孵育3 h, 置4 °C备用。用Waters Alliance 2695 及 QTOFMicro 进行测定。上样量30 μL; 使用80 min 连续梯度, 流动相B 由5%~ 45%; 质谱扫描范围: m/z100~3 000; 其余条件同分子量测定。

1.6 串联质谱分析 样品前处理同“液质肽图测定”，用Waters ACQUITY H-Class 及Xevo G2 QTof 测定。液相参数:柱温为50 °C;样品保存温度为8 °C;流速0.2 mL·min−1;上样量10 μL;使用80 min 连续梯度，流动相B 由5%~50%;质谱 参数毛细管电压:4200 V;Cone 电压:30 V;去溶剂气体温度:200 °C;源温: 80 °C;去溶剂气体流速:800 L·h−1;扫描范围:m/z 100~2 500;MSe模式采集。 1.7 抗原抗体结合活性测定 采用ELISA 法进行测定。以 2μg·mL-1 的 CD147-6His，每孔200μL 包被酶标板，4 °C放置过夜。用前洗板3 次，然后以每 孔200 μL 加入封闭液，置37 °C封闭2 h。参考品和供试品预稀释到100 μg·mL-1， 再进行10倍梯度稀释，共稀释成8个浓度。洗板4 次后，取稀释好的待检样品、 参考品按每孔100 μL 加入酶标板中( 两者均做2 复孔) ，37 °C放置1 h。洗板3 次，然后每孔加入100 μL 的1∶ 10000 稀释的Ap-羊抗人IgG(H+L)抗体 ，37°C 反应0.5h。洗板3次，每孔加碱性磷酸酶底物pNPP 100 μL，室温静置20 min。用 酶标仪读取A405值并作图，横坐标为美妥珠单抗浓度，纵坐标为A405的平均数， 利用四参数方程进行曲线拟合，并按以下公式计算结果: 供试品相对结合率( %) = 参考品EC50 /供试品EC50 × 100%。

1.8 ADCC 效应试验 取对数生长期 A549 细胞，以 3000 个/孔加入 96 孔板， 将美妥珠抗体及理化对照品分别用含有 5%胎牛血清的 RPMI1640 培养基稀释至

10μg/ml，再进行 10 倍梯度稀释，共 7 个梯度，20μl /孔分别加入试验孔。取新

鲜外周血分离的淋巴细胞按效靶比 40:1 的比例分别加入试验孔、效应细胞自发

孔;于培养基自发孔及体积校正孔加入 5%胎牛血清的 RPMI1640 培养基 120μl，

同时将靶细胞最大孔、靶细胞自发孔、效应细胞自发孔体积补足至 120μl;250g

离心 4min 后于 37%CO2 培养箱内孵育 4h;结束培养前 45min，向靶细胞最大和

体积校正孔中加入裂解液(10X)，20μl /孔;250g 离心 96 孔板 4min;将 50μl 上清

液转移到酶分析板中，把配好的底物以 50μl/孔加到酶分析板中，室温避光孵育

20min;加入终止液后在 490nm 处读值。将所有实验孔、靶细胞自发孔和效应细

胞自发孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值;将靶细胞最大孔吸光值减去体

积校正对照吸光值的均值;按下面公式，计算所产生的杀伤率。

杀伤率 (%) =

实验-效应细胞自发-靶细胞自发 靶细胞最大-靶细胞自发

×100%

1.9 其他指标检测 外观、pH、内毒素、无菌试验、装量、不溶性微粒、鉴别、 异常毒性、渗透压等项目按中国药典2010 年版三部规定进行检定。蛋白质含量 采用紫外分光光度法测定，残留CHO 细胞DNA 采用定量PCR 测定，残留CHO 细胞蛋白和蛋白A 含量采用美国CygnusTechnologies 公司相应的ELISA 试剂盒 进行测定。
 

2 结果
2.1 纯度分析 成品通过非还原CE-SDE法测定纯度，主峰面积占总面积的 97.5%，样品的主峰迁移时间均值26.7分钟。通过SEC-HPLC 测定纯度，单体 峰含量大于98. 0%，二聚体和多聚体含量小于1.0%(图1)。

图1 SEC-HPLC对美妥珠单抗进行纯度分析结果

2.2 抗原抗体结合活性 利用ELISA 法测定1 批成品和参考品对CD147 的结合 活性，数据经SOFTMAX软件分析后，拟合曲线呈典型的“S”型，曲线拟合相关 系数在0. 99 以上(图2)，以图中C 值作为EC50值，计算得到成品的平均相对 结合力为86%。

图2 ELISA法测定与抗原CD147的结合力剂量反应曲线，横坐标为样品浓度(g/ml)，纵 坐标为平均吸光值。
 

目前治疗性单克隆抗体药物已经成为生物制药中增长最快的领域，单抗药物 以靶向性强、疗效明确、副作用小等优势在自身免疫性疾病、癌症等领域应用广 泛，一直受到药物研发人员的关注，并且随着研究的不断深入，单抗在制药行业 中所占的比重越来越大，在临床的治疗应用中发挥的作用越来越大，因此制订出 切实可行的能够保证单抗类制品安全有效的质量标准具有非常重要的意义[6-8]。

由于美妥珠单抗的生产细胞为经过糖基化改造的细胞株，该细胞表达的抗体 糖型较为单一，ADCC杀伤效应显著增强。本研究结果显示，与人IgG相比，针 对靶细胞肺腺癌A549细胞，美妥珠单抗的ADCC杀伤效应明显增强。另外，针对 美妥珠的特异性抗原CD147分子，我们设计了体外酶联免疫反应检测抗原抗体的 结合活性，该方法与细胞水平的试验相比，可操作性强、精确性和耐用性好。两 者结合，充分反映了该单抗能封闭抗原、增强ADCC效应的活性。对于药物质量 控制的另一关键项目纯度，我们采用毛细管电泳和高压液相两种不同的纯度测定 方法，对美妥珠的纯度进行了测定。结果显示，该制品的纯度均在95%以上，二 聚体和多聚体含量小于0.5%。

重组技术表达产品是经重组构建、在外源细胞系中表达的蛋白产品，在重组 技术产品的质量控制过程中，样品的纯度、肽图、分子量大小、等电点等多项检 测都要与理化对照品进行比对，将是否与理化对照品一致作为评判样品是否合格 的标准，而理化对照品的结构是否正确、是否是所要表达的蛋白分子、能否作为 样品质量控制的参比品?因此对理化对照品的结构确证是非常必要的。本研究 中，我们利用液质联用技术分别对美妥珠单抗进行了分子量、质量肽图及糖型等 结构分析。结果显示，分子量及氨基酸序列均与理论预测一致，而且该制品的糖 型为单一高甘露糖型，未发现能够抑制ADCC效应的岩藻糖修饰，进一步验证了 其具有增强的ADCC杀伤效应。在本研究中，我们同时建立了美妥珠单抗理化对 照品的质量标准。在重组技术产品质量研究中，根据每一种产品的特性，在理化 对照品质量标准研究中，还应选择性地考虑以下检测项目:紫外光谱、园二色谱、 水分、pH值、渗透压摩尔浓度等。

应用本研究建立的质控方法和质量标准，对我国首次申报注册的美妥珠单抗 进行了质量复核，其各项指标均符合《人用重组DNA 制品质量控制技术指导原 则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》和2010 年版中国药典三部的 有关要求，表明该质控方法和质量标准具有保证产品安全、有效、质量可控的特 点，可用于该制品的常规检定。

参考文献:

1. Kanekura T, Chen X, Kanzaki T. Basigin (CD147) is expressed on melanoma cells and induces tumor cell invasion by stimulating production of matrix metalloproteinases by fibroblasts. Int J Cancer. 2002;99:520–528
2. Chen X, Lin J, Kanekura T, et al. A small interfering CD147-targeting RNA inhibited the proliferation, invasiveness, and metastatic activity of malignant melanoma. Cancer Res. 2006;66:11323–11330

3. Li QQ, Wang WJ, Xu JD, et al. Involvement of CD147 in regulation of multidrug resistance to P-gp substrate drugs and in vitro invasion in breast cancer cells. Cancer Sci. 2007;98:1064–1069

4. Zucker S, Hymowitz M, Rollo EE, et al. Tumorigenic potential of extracellular matrix metalloproteinase inducer. Am J Pathol. 2001;158:1921–1928

5. 陶磊, 饶春明, 高凯，等 重组嵌合抗CD20 IgG1单克隆抗体的结构确证，药学 学报, 2010, 45: 752−755.

6. Reichert JM, Rosensweig CJ, Faden LB, et al. Monoclonal antibody successes in the clinic. Nat Biotechnol 2005; 23:1073-8
7. Reichert JM. Antibodies to watch in 2010. MAbs 2010; 2:84-100
8. Oldham RK, Dillman RO. Monoclonal antibodies in cancer therapy: 25 years of progress. J Clin Oncol 2008; 26:1774-7